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反應操作、柱層析、蒸餾等實驗室工作經驗分享
發布時間：2023-05-19瀏覽次數：1556
實驗室工作有很多是經驗性的，有很多細節是課本上沒有的，但是在實驗室實際應用中又非常重要，本文我總結了一些自己在多年的實驗室工作經驗，主要是一些個人習慣。良好的實驗室習慣的養成，往往會是一個很好的開始，它是避免人為反應失敗的[敏感詞]的利器，也是提高效率，避免人力浪費的很好的助力。
[敏感詞]部分：反應操作
1，原則上所有的反應都不能用塞子塞住，從而造成反應在狹小的密閉空間下反應，必須在出口處街上氮氣球或者三通（特殊的如高壓反應或 sealed tube 反應除外），以免因反應放熱或產生氣體而發生沖料或者發生爆炸。
2，處理反應時選擇合適的容器，[敏感詞]在預估的所有體積的二到三倍之間，以免出現容器過滿的狀況。
3，任何反應若非會放出含 H+之物質，均應盡可能在惰氣（氮氣或氬氣）系統下操作，以避免不必要之副反應（side reaction）。如必須于惰氣系統下操作則以使用惰氣氣球系統為宜。
4，標準惰氣系統反應處理方式是將反應器皿于烘箱中取出后迅速放入攪拌子并連接氮（氬）氣出口之后迅速將反應所需設備組合起來，并用火焰干燥，然后抽真空再灌入氮（氬）氣，并重復兩次。
5，任何一未知反應，除非有極近似之反應作參考，否則應從0℃或室溫開始嘗試，若不反應再逐步升高其溫度，反之若反應太快有副作用時，再降低其溫度。
6，任何一未知反應于 set up 完成后30 分鐘內即應檢查反應進行之情況，我們可取適量之原液(Aliquots)以TLC，NMR，GC，IR 或其他適當的技巧檢驗之。確定其反應進度后，才可決定是否在原條件下反應，切不可任意由其反應，或work-up 而不予檢查。
7，檢查反應時若發現超過 3 小時沒有任何變化（反應）發生則可嘗試逐漸升高溫度10-30℃，然后再等十分鐘后檢查其變化，若再過一小時后仍無反應則再升高溫度10-30℃，如此反復嘗試直到反應發生為止。
8，任何一反應若需加熱或反應中可能生熱時必須加裝冷凝管以確保物質不會揮發散失。
9，若反應之溶劑為低沸點物質（如乙醚，二氯甲烷等）則冷凝管內需通冰水，否則溶劑可能揮發散失，尤其在加熱回流時，不注意會造成反應物濃度過高，甚至干涸。
10，怕水而需低溫反應，先Set-up 好所有的equipment、solvent，及部分不會產生反應之試劑，最后才以冷媒冷卻反應系統，否則在set-up 時易有水汽進入，影響反應效果。
11，如果反應之產物 NMR 無法解釋，應立即點TLC 以檢查其純度，如果不純則NMR圖譜之積分自然無法解釋，應純化后再測。
12，任何新反應在完全定案前，所有嘗試反應之產物，請務必予以保留，即使非我們所預期的產物或混合物，均有保留及比較TLC 的價值。
13，反應后務必將所有“有意義”之TLC plates 按原尺寸畫于筆記薄上，以便以后比較用。
14，下班前應盡力完成第二天實驗之準備工作，如明日需用之干燥玻璃器皿，設備，或找好需用的試劑及溶劑等。
15，如預期反應需超過 12 小時，宜盡量利用下午或晚上set up 反應。如預期反應需超過36 小時，宜盡量利用周5 或周6 set up，以求節省時間提高效率。
第二部分：柱層析
1，一般而言極性大的物質在極性固定相上的移動速率最小（因其吸引力[敏感詞]）反之極性小的物質在極性固定相上的移動速率[敏感詞]。但所有物質使用高極性流動相時在極性靜相時之移動速率均增大。故依各分離物質的極性選擇極性適當的固定相及流動相甚至其用量均為層析（Chromatography）成功之關鍵。
2，任何化學物若以 TLC 鑒定其純度，其所顯示的Rf 值超過0.7 或低于0.1 時，均無法確定其是否為單一點（one spot），因為在此種Rf 值時，許多Rf 較接近的點會重合。因此我們所選擇觀察物最適合之Rf 值為0.3-0.5。
3，Run Column 時所選用之solvent 系統應配合選用硅膠（stationary phase）的用量及sample（樣品）的量來選擇其極性組合，一般而言欲分離之主樣品Rf 值以0.15-0.25為宜。
4，一般最常用之 Solvent 依其極性大小依次為n-Hexane(or pet.ether)<EtOAc<MeOH，組合為最通用，其他如Ether 也常為中極性之溶劑，對于氨類氯化溶劑如CH2Cl2,CHCl3常有特殊的效果，而Benzene 對含芳香性之化合物也會有出人意外之好效果。
5，Run Column 所用之Solvent 在配好后，應以TLC 再作檢測一次，以確定是否為恰當之Solvent 系統。尤其若需要收集一點時，則在分離前之混合物必須留一些以便作比較參考用。
6，在填裝層析管（packing column）時若不慎有氣泡（如Solvent 部分流干）可補滿Solvent后以木棒（或簽字筆）輕敲管壁，讓氣泡浮出。因為氣泡中沒有硅膠，分離物流經此處時移動速度會比其他處快，而造成此區域分離物與其他無氣泡處之分離物排列次序混亂之現象，影響分離效果。
7，在 Run Column 時所收集的分離份（fraction）體積（毫升）通常為硅膠克數的1/4 以下。實際情況可用下列公式來求出約略值，如欲分離成分A 與B，而A 之Rf 值為0.3，B 之Rf 值為0.2 則最適合之分離份（fraction）體積為：設硅膠量為50g
8，在作層析時，如何濃密而又均勻的將樣品 Loading 在起始點乃是層析分離成功與否的關鍵。通常的做法是將樣品溶解在不超過其體積兩倍之低極性溶液，然后小心的將樣品涂布于起始點。柱層析（Column Chromatography）時務必等樣品液完全進入固定相（Stationary phase）后，以少許溶劑再將管壁上沾著的樣品沖入固定相后，才可正式加溶劑開始 Run Column。由于大部分化合物在低極性溶劑中溶解度很差，我們也可以將樣品均勻地與少量硅膠混合后干法上樣。這也是我們采用最多的方法。
9，在 Run Column 時切記不可使Column 內溶劑過少而使靜相頂端干涸，且在添加溶劑也要小心，不可使溶劑急沖而下破壞靜相之頂層，尤其在剛開始Run Column 時，否則將造成樣品之過量稀釋分散，從而嚴重影響層析效果。
10，在收集時，可以先行以 Rf 值以固定相之總量計算大約樣品出現時之流出溶劑體積，在此體積達1/2 量前可以大瓶收集，1/2 量之后再以預定之小容器分別收集。
11，Run Column 時Solvent 之流速一般而言（HPLC,MPLC 除外），流速均以越快越好，因為一般而言Mobile Phase Velocity 與Plate height 成反比，而Plate heigh 越小越好，故動相流速是越快越好。故Flash Chromatography 之效果常較一般Gravity column 為佳。
第三部分：蒸餾
1，蒸餾時務必先判斷你們樣品在其沸點時是否會分解，否則就必須選擇減壓蒸餾或其他的分離方法。
2，一般實驗室的蒸餾僅用于分離沸點差 50℃以上物質。（通常只是用于除去溶劑或有色的高分子粘滯物）。如欲分離沸點較接近之物質則需加裝分餾管，而分餾管之長度即裝填物需視分離之物質沸點接近之程度而定。一般而言，沸點差小于20℃或總量小于1 克，則需特殊裝置（如Spinning band or molecular distillation）否則便無法做分餾了。
3，蒸餾時其外加熱媒之溫度與蒸出沸點差至少會在 30℃左右。
4，在做減壓蒸餾前，務請查明所有欲蒸餾物的沸點，以免于壓力速降時造成‘突沸’而造成整個樣品沖出。尤其需注意溶劑是否已在Rotary evaporator 上抽干。
5，如果無參考圖表，可約略以下法計算各物質之低壓沸點。通常壓力由760mmHg 減至25mmHg 其沸點降低100℃，其后壓力每降低一半，其沸點降低10℃。
6，若兩個或更多物質混合時，通常會形成各種成分之共沸物。而在較低的溫度即沸騰汽化而出。此種情形最常發生于樣品含溶劑的狀況。
7，減壓蒸餾時，務必加裝冷卻 Trap，否則不但可能因樣品被吸入泵而失去樣品，也會損壞真空泵。
第四部分：其他日常操作
1，使用樣品后盡可能將其歸還回原位，尤其需冷藏或干燥者必須封好后放回原位。所有裝于燒瓶內之化合物，應隨時標明編號（以膠帶粘貼以便清除）。
2，烘箱非儲藏柜僅僅用于烘干玻璃器皿，烘干后需在近期內（一天內）使用者才放入，其余物品均應放于抽屜或涼干架。
3，如果 Solvent 或低沸點物（bp<150℃）能在Rotary evaporator 上清除者，必須先在Rotaryevaporator 上處理至不能再濃縮后，才可放上Vacuum pump。否則低沸點物可能被抽入泵中。
4，使用 Vacuum pump 必須要干冰作Trap 之冷媒，使用前必檢查Trap 內是否有殘留物，若有，則需清除后方可使用。并在使用完后立即清理Trap 之廢物。
5，萃取時選用之 Solvent 應注意其比重，若其比重大于1（如CH2Cl2, CHCl3, CCl4）而反應原液為比重小于1 之溶劑，(如Ether, THF 或Benzene)時，切不可同時混入分液漏斗，否則會有乳化不分層之現象，造成分離困難。
6，當溶液裝于有磨口的容器內時，在任何操作狀況時，均應避免使溶液接觸到磨口，因為當溶劑揮發后溶質將殘留在磨口上，會使你損失所要的Compound,而在加蓋常會有打不開之現象。所以若不慎或有不得以有溶液接觸磨口，則應以純溶劑浸潤接觸部分，務使溶劑殘留之痕跡消除為止。
7，實驗記錄本應包含反應方程式，參考文獻，試藥用量（Weight,Mole）,理論產率，實驗步驟，TLC，光譜記錄，與注意事項或結論。
8，實驗室對量的記載應盡量保持三為數字，以求其[敏感詞]性；對不滿 1 之單位應用下一級之單位。如0.1 克應寫為100mg，0.1mol 應寫為100mmol。
9，實驗本務必按進度如實記錄，要如實做到‘做到哪里，寫到哪里’，而且不得帶出實驗室。實驗記錄務必跟隨實驗進度將所有事實詳細記錄，成功之反應必有產物，產率，顏色，狀態及純化方式，失敗之實驗必說明鑒定失敗的方法及證據，并盡可能說明原因。
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